哈希1英寸方形比色池帶蓋DR2800樣品瓶

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 比色方法
一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。
Lowry 法：以早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2 反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret 相比，Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑；反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng)；容易受到非蛋白物質(zhì)的影響；含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。
BCA（Bicinchoninine acid assay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2 反應(yīng)產(chǎn)生Cu ，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線(xiàn)性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。
Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測(cè)試方法的2 倍；操作更簡(jiǎn)單，速度更快；只需要一種反應(yīng)試劑；化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果；而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無(wú)可比性。
某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不*，感到迷惑，究竟該相信哪種方法？由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無(wú)可比性。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測(cè)出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不*，測(cè)試后的濃度也不*。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類(lèi)似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問(wèn)題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問(wèn)題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。

細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）
實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長(zhǎng)密度和生長(zhǎng)期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測(cè)推斷細(xì)菌的生長(zhǎng)密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對(duì)每種微生物和每臺(tái)儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線(xiàn)。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測(cè)試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。
分光光度計(jì)的重要配件—— 比色杯
比色杯按照材質(zhì)大致分為石英杯、玻璃杯以及塑料杯。根據(jù)不同的測(cè)量體積，有比色杯和毛細(xì)比色杯等。一般測(cè)試核酸和紫外定量蛋白，均采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測(cè)定。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料（如考馬斯亮蘭）能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品。